Características histoquímicas y bioquímicas de las fibras del músculo Gluteus medius en equinos de tiro descendientes del Plan de Fomento Equino (página 2)

MATERIAL Y MÉTODOS

Se utilizaron 14 hembras y 2 machos equinos mestizos de
tiro F1, clínicamente sanos, producto de la
cruza de hembras de tiro criollo con potros Bretones y
Ardanés del Plan de Fomento
Equino, pertenecientes al fundo Pupunahue de la X Región.
Todos los animales no
realizaron faenas agrícolas durante 90 días previo
a la obtención de las biopsias y recibieron la misma
alimentación en base a praderas naturales
mejoradas y suplementados con heno de trébol durante el
invierno.

El peso promedio fue de 650 ± 40 kg y la edad
fluctuó entre 5 y 15 años.

Biopsias musculares. Se obtuvieron dos muestras
de biopsia del lado izquierdo del músculo Gluteus
medius mediante aguja de biopsia de Lindholm y Piehl (1974) a
15 cm de la tuberosidad coxal en dirección dorsocaudal a la base de la cola.
Se obtuvieron las muestras a 3, 6 y 9 cm de profundidad en el
mismo sitio. Un trozo de tejido muscular se cubrió con OCT
(Tissue tek, Miles Sci USA) y seguidamente se sumergió en
isopentano en frío (-60° C) por 2-3 minutos.
Posteriormente, las muestras se mantuvieron en nitrógeno
líquido hasta su procesamiento. Otro trozo de tejido se
guardó en tubos en nitrógeno líquido hasta
la determinación de las enzimas.

Técnicas histoquímicas. Se
obtuvieron 24 cortes de biopsias musculares de cada profundidad
(3, 6 y 9 cm), de 10 µm de grosor en un crióstato
(Micrón HM 500) a -20°C. Los cortes para determinar la
actividad miosina ATPasa y actividad oxidativa fueron procesados
según las técnicas
descritas por Brooke y Kaiser (1970). Realizadas las
técnicas, se tomaron dos microfotografías para cada
profundidad de biopsia y para cada reacción
enzimática, utilizando un fotomicroscopio marca Leitz con
aumento 100x.

En las fotografías, realizadas en blanco y negro,
se contó y se clasificó un total de 200 fibras
musculares y se hizo el cálculo
porcentual promedio de cada tipo de fibra con la técnica
ATPasa. Posteriormente se calculó el área y
diámetro menor de ellas por medio de un programa para
análisis de imágenes
por computación de la Facultad de Veterinaria de
la Universidad de
Córdoba, España.
Los porcentajes de fibras oxidativas y no oxidativas se
determinaron contando 100 fibras por biopsia teñida con la
tinción nicotín amida tetrazolium reductasa
(NADH-TR) (Brooke y Kaiser, 1970).

Determinaciones de actividades
enzimáticas. Las biopsias fueron descongeladas
sólo en el momento de procesarlas. En 50 mg de tejido
muscular, previa extracción del tejido conectivo y graso,
fue centrifugado 3 veces a 1.000 g en 5 ml de tampón
fosfato pH 7.3 (PBS)
frío. Posteriormente, el sedimento se solubilizó en
10 ml de PBS y se homogeneizó a 8.000 rpm en triturador
Turex-X durante 30 segundos. Luego se sonicó por 20
segundos y se centrifugó a 7.000 g durante una hora a
4°C (Rudolph y col., 1993).

En el sobrenadante se determinaron las enzimas CK, LDH y
CS. La actividad de las enzimas CK (E.C. 2.3.2.2.) y LDH (E.C.
1.1.1.27) se realizó usando métodos
cinéticos con reactivos comerciales (Boehringer Mannheim)
y la actividad de la CS (E.C. 4.1.3.7.) se determinó
según la técnica descrita por Alp y col.
(1976).

La determinación de las proteínas
totales se realizó utilizando el método de
Lowry y col. (1951).

Análisis estadístico. Los
resultados fueron analizados estadísticamente,
determinándose la media (X) y desviación
estándar (DE) de cada variable y se realizó un
análisis de varianza para determinar si las diferencias
por efecto de la profundidad de la biopsia eran significativas.
Además, se correlacionó el tipo de fibra con la
actividad enzimática.

RESULTADOS

La distribución del porcentaje de fibras del
músculo Gluteus medius en el equino mestizo de tiro
mejorado adulto se presenta en la tabla 1. Se puede observar que
el porcentaje promedio de fibras tipo I fue de 33% y aumenta con
la profundidad de la biopsia de un 21% a 3 cm, 31% a 6 cm y 46% a
9 cm, siendo esta diferencia estadísticamente
significativa (p<0.05) (fig. 1).

El porcentaje promedio de fibras tipo IIA fue de 28%, no
presentando variaciones significativas al relacionarlas con la
profundidad de la biopsia. El porcentaje promedio de fibras tipo
IIB fue de un 40%, siendo de un 52% a los 3 cm de profundidad y
disminuyendo a un 27% a 9 cm de profundidad, siendo esta
diferencia estadísticamente significativa
(p<0.05).

Al analizar la capacidad oxidativa de las biopsias
musculares mediante la técnica de NADH-TR se
determinó que el porcentaje promedio de fibras tipo IIB
oxidativas fue de 17%, no existiendo diferencias a las distintas
profundidades de muestreo
(p>0.05) (tabla 1, fig. 2).

El porcentaje promedio de fibras tipo IIB no oxidativas
fue de 22%, existiendo diferencias significativas entre la
profundidad a 3 cm, respecto a la de 6 cm y a la de 9 cm
(p<0.05) (tabla 1).

El área promedio de las fibras tipo I, IIA y IIB
fue de 3.966, 4.830 y 7.052 µm2 respectivamente, no
presentando variaciones significativas por efecto de la
profundidad de la biopsia; sin embargo, las fibras tipo IIB
presentan un área mayor (p>0.01) que las fibras tipo I
y IIA en las tres profundidades de muestreo y las fibras tipo IIA
a la profundidad de 9 cm presentan una mayor área que las
fibras tipo I (p<0.05) (tabla 2).

Tabla
1.
Tipos de fibra (%) del músculo Gluteus medius en
equinos de tiro mestizos inactivos,
presentados como promedios (X) y desviación
estándar (D.S.). Fibre types (%) of Gluteus medius
muscle in inactive mixed draught horses presented as mean values
and standard deviation.

Figura 1.
Porcentaje de los tipos de fibras del
músculo Gluteus medius en equinos de tiro mestizos
a 3, 6 y 9 cm de profundidad de biopsia.
Percentage of the fibre types of Gluteus medius muscle
in inactive mixed draught horses at 3, 6 and 9 cm of depth of
biopsy.

Tabla
2.
Area (µm2) y diámetro menor (µm) de las fibras
de músculo Gluteus medius en equinos de tiro mestizos
presentados como promedios (X) y desviación
estándar (D.S.).
Area (µm2) and minimun diameter (µm) of the fibres of
Gluteus medius muscle in inactive mixed horses presented as mean
values and standard deviation.

Figura 2.

Porcentaje de fibras tipo IIB oxidativas y no oxidativas a
3, 6 y 9 cm de profundidad de la biopsia.
Percentage of the fibre types IIB oxidative and non oxidative at
3, 6 and 9 cm of depth of biopsy.

Tabla
3.
Actividad enzimática del músculo Gluteus
medius en equinos de tiro inactivos presentados como
promedios (X) y desviación estándar (D.S.).
Enzime activity of Gluteus medius muscle in inactive mixed
draught horses presented as mean values and standard
deviation.

El diámetro menor promedio de las fibras tipo I,
IIA y IIB fue de 47, 52 y 59 µm respectivamente y no
presentó variaciones significativas por efecto de la
profundidad de la biopsia, aunque las fibras tipo IIB tienen el
diámetro menor más grande (p<0.05).

En relación a las actividades enzimáticas,
se observó que la actividad promedio de las enzimas CK,
LDH y CS fue de 0.484, 0.337 y 671 µmol/min/mg
proteína, respectivamente (tabla 3).

El promedio de la actividad de CK a los 3 cm de
profundidad fue de 0.506 µmol/min/mg proteína, la
cual disminuyó a 0.399 µmol/min/mg proteína a
los 9 cm de profundidad, siendo este descenso
estadís-ticamente significativo (p<0.05) (tabla
3).

El promedio de la actividad de la LDH fue de 0.452
µmol/min/mg proteína, disminuyendo a 0.400
µmol/min/mg proteína a los 6 cm de profundidad y al
0.159 a los 9 cm de profundidad, siendo este descenso
significativo respecto a los 3 y 9 cm de profundidad (p<0.05)
(tabla 3).

El promedio determinado para CS a los 3 cm de
profundidad fue de 357 µmol/min/mg proteína, la cual
aumentó a 630 y 1.206 µmol/min/mg proteína a
los 6 y 9 cm de profundidad, respectivamente, siendo este aumento
significativo (p<0.05) (tabla 3).

El análisis de correlación entre el tipo
de fibra y la actividad enzimática demostró que
existe correlación positiva (p>0.05) solamente entre la
actividad de la enzima CS y las tres profundidades de
muestreo.

DISCUSIÓN

El caballo mestizo de tiro es producto de la cruza de
hembras de tiro criollo con potros Ardanés y Bretones
finos pertenecientes al Plan de Fomento Equino. La
composición fibrilar del músculo Gluteus
medius en el caballo mestizo de tiro en condiciones de reposo
no ha sido analizada previamente y los resultados se comparan con
los obtenidos en el mestizo de tiro criollo y otras
razas.

Los tipos de fibras encontradas en este estudio fueron
tipo I, IIA y IIB, no observándose fibras tipo IIC,
situación semejante a la observada por
Essén-Gustavsson y col. (1980), Ronéus y Lindholm
(1991) e Islas y col. (1996).

Los equinos mestizos de tiro presentan un mayor
porcentaje de fibras tipo I y menor porcentaje de fibras tipo II
comparados con los de otras razas, según los trabajos
realizados por Snow y Guy (1980) y López-Rivero y col.
(1990). Estos resultados son compatibles con el trabajo que
efectúa el caballo de tiro, cuyo ejercicio es sostenido y
a baja velocidad
(Bou, 1994), para lo cual necesita un porcentaje alto de fibras
tipo I en las cuales predomina el metabolismo
aeróbico. Diversos estudios han demostrado que la
composición de la fibra del músculo Gluteus
medius en el equino (Wool y col., 1988;
Essén-Gustavsson y col., 1989) presenta diferencias
según la profundidad de la biopsia (Raub y col., 1985;
Islas y col., 1996), situación también observada en
esta investigación.

En las biopsias se observó que el porcentaje de
fibras tipo I aumentó significativamente con la
profundidad. Algunos investigadores sostienen que a mayor
profundidad el músculo Gluteus medius realiza un
metabolismo predominantemente oxidativo, permitiendo una mejor
adaptación de él para funciones
posturales y actividades dinámicas de bajo nivel y larga
duración (Kline y Bechtel, 1988; López-Rivero y
col., 1993; Islas y col., 1996).

El porcentaje de fibras tipo IIA se mantiene sin
variación en las distintas profundidades estudiadas,
siendo similar al caballo de tiro chileno (Islas y col., 1996) y
menor al observado en el equino fina sangre
(Ronéus y Lindholm, 1991) y en el caballo Andaluz,
Anglo-Arabe y Arabe (López-Rivero y col., 1989). El bajo
porcentaje de fibras tipo IIA encontrado en esta
investigación se relacionaría con el tipo de
trabajo que
los equinos realizan.

Los porcentajes de las fibras tipo IIB, que se
caracterizan por tener generalmente una baja capacidad oxidativa,
en este estudio son menores a los encontrados en otras razas
(Essén-Gustavsson y col., 1980; López-Rivero y
col., 1990; Ronéus y Lindholm, 1991). Los porcentajes de
fibra tipo IIB oxidativas y no oxidativas disminuyen con la
profundidad de la biopsia en forma significativa. Estas fibras
participan en la generación de fuerza
propulsiva rápida e intensa, pero de corta
duración, características fundamentales para los
caballos FS de carrera (Ronéus y Lindholm, 1991), a
diferencia del caballo de tiro que realiza un trabajo lento y
sostenido a baja velocidad y con mayor fuerza (Bou,
1994).

El área de las fibras del equino de tiro mestizo
es mayor al obtenido en otras razas en condiciones de reposo
(Essén-Gustavsson y Lindholm 1985; López-Rivero y
col., 1993), lo que se relacionaría con el volumen del
músculo Gluteus medius que tienen estos
equinos.

El diámetro mínimo obtenido en las fibras
tipo I, IIA y IIB es similar al de otras razas
(López-Rivero y col., 1990), no observándose
diferencias con la profundidad de la biopsia. El diámetro
mínimo es importante debido a su relación con la
fuerza isométrica generada en la contracción y a su
abastecimiento capilar. Las fibras tipo I y IIA son de menor
diámetro, tienen proporcionalmente un mayor abastecimiento
capilar, lo que favorece la difusión de oxígeno
y sustratos al interior de las células,
al mismo tiempo que
facilitan la eliminación más rápida de los
productos
catabólicos (Essén-Gustavsson y col., 1989). Las
fibras tipo IIB, de mayor diámetro, están mejor
adaptadas para realizar una contracción de alta intensidad
y breve duración, ideal para caballos de carrera
(López-Rivero y col., 1989; López-Rivero y col.,
1991).

El análisis de la actividad enzimática
específica obtenida a distintas profundidades del
músculo Gluteus medius muestra cambios
que lo relacionan con el tipo de fibra presente en las diferentes
profundidades. Así, en las biopsias más
superficiales (3 cm) se observa una mayor actividad
específica de la enzima LDH respecto a la actividad de las
enzimas CK y CS. El músculo del equino mestizo de tiro a
esa profundidad está constituido principalmente por fibras
tipo IIA y IIB no oxidativas, que se caracterizan por tener un
alto metabolismo glucolítico netamente anaeróbico
(Kline y col., 1987; López-Rivero y col., 1992), ya que
están involucradas en la generación de fuerza
propulsiva de alta intensidad y de corta duración (Valberg
y col., 1993).

En las biopsias de 6 cm de profundidad se observan
valores de CK
y LDH similares a los de la profundidad de 3 cm, lo que
está relacionado con un aumento del porcentaje de las
fibras tipo I y un descenso de las fibras tipo IIB. El aumento de
las fibras tipo I se refleja en un incremento de la actividad de
la enzima CS, lo que indica utilización del metabolismo
oxidativo, propio de las fibras tipo I y IIA. Estos resultados
son similares a los obtenidos por nuestro grupo en
equinos de tiro criollo (Islas y col., 1996) y a los observados
por López-Rivero y col. (1995) en caballos sometidos a
eventos de
resistencia.

En las regiones profundas del músculo (9 cm) la
fibra predominante en los equinos mestizos de tiro mejorado es la
tipo I, capacitada para realizar metabolismo aeróbico,
utilizando sustratos extracelulares para la obtención de
energía. La fibra tipo I está mejor adaptada para
mantener la postura y actividades de larga duración, pero
de baja intensidad (Snow y col., 1983; Bechtel y Kline, 1987),
característica de los equinos de tiro analizados en este
estudio, los cuales cumplen jornadas de trabajo continuo y a baja
velocidad, por lo que la mayor actividad de CS a esta profundidad
permitiría una mejor regulación de flujo de
sustratos hacia las fibras durante ejercicios submáximos
de larga duración y poca intensidad. Este mecanismo
podría mejorar la eficiencia en la
utilización de la energía dentro de las fibras
musculares, disminuyendo el riesgo de fatiga
muscular durante ejercicios de resistencia (Snow y Guy, 1981;
Essén-Gustavsson y Lindholm, 1985).

Se ha demostrado que existe una correlación
significativa entre el tipo de fibra y la actividad
enzimática (Lindholm y Piehl, 1974; Snow, 1981;
Essén-Gustavsson y col., 1984; López-Rivero y col.,
1992), como se observó en este trabajo entre la fibra tipo
I y la actividad de la enzima CS, lo que estaría dado por
las condiciones de reposo en que se encontraban los equinos, ya
que el metabolismo muscular realizado por ellos sería
esencialmente aeróbico, observándose aumentos
significativos de la actividad CS en relación con la
profundidad de la biopsia, la cual se caracteriza por tener un
elevado porcentaje de fibras tipo I, resultados similares a los
obtenidos por Essén-Gustavsson (1984) y Hodgson y Rose
(1987).

De los resultados obtenidos en esta investigación
se puede concluir que el músculo Gluteus medius del
equino mestizo de tiro descendiente del Plan de Fomento Equino
presenta un metabolismo preferentemente oxidativo, expresado por
una mayor proporción de fibras de contracción
lenta, tipo I y una elevada actividad de la enzima CS. Estas
características del músculo son consistentes con el
tipo de trabajo realizado por estos animales: labores
agrícolas de baja intensidad y larga
duración.

* Proyecto FONDECYT
1941005

AGRADECIMIENTOS

Los autores desean agradecer al Fundo Pupunahue las
facilidades brindadas para realizar esta
investigación.

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